In quest´opera Leonardo rappresenta le emozioni dei protagonisti della storia, Gesù e gli Apostoli. Sappiamo che per il pittore è molto importante illustrare i ”moti dell'animo”: nel suo Trattato della Pittura scrive che il bravo pittore deve saper rappresentare non solo l'aspetto esteriore dell'uomo ma anche i suoi pensieri,  le sue emozioni; la prima cosa non è difficile da fare, ma la seconda sì, perché pensieri ed emozioni si devono rendere con i gesti e gli atteggiamenti (Lo bono pittore ha da dipingere due cose principali, cioè  l'homo e il concetto della mente sua. Il primo è facile, il secondo difficile perché s'ha a figurare con gesti e movimenti delle membra)

Per questo motivo Leonardo decide di rappresentare il momento successivo alle parole di Gesù "Uno di voi mi tradirà". È il momento più drammatico della Cena: ogni apostolo si domanda, e domanda agli altri, chi può essere il traditore. Leonardo si concentra sull'effetto che le parole di Gesù provocano sugli apostoli, sulla loro reazione: proprio per questo cambia il modo di rappresentare la scena rispetto agli artisti precedenti.
Prendiamo ad esempio l'Ultima Cena di Andrea del Castagno (1450):

Giuda, il traditore, è rappresentato, da solo, davanti alla tavola mentre gli altri apostoli, e Gesù, sono tutti dall'altro lato, uno accanto all'altro. La scena è solenne, ma non particolarmente drammatica. Invece Leonardo rappresenta Giuda in mezzo agli altri apostoli e organizza quattro gruppi di tre figure ai lati di Gesù, che sta al centro. Gesù e Giuda sono gli unici immobili e calmi, diversamente dagli altri che sono agitati e sconvolti: solo loro due sanno la verità. Giuda è anche l'unica figura del dipinto in ombra. La scena è molto drammatica.

Per la descrizione ci aiutiamo con una copia del Cenacolo dipinta nel 1520 dal Giampietrino. Cominciamo da sinistra. Il primo gruppo è formato da tre personaggi in piedi: Bartolomeo, Giacomo Minore e Andrea. Bartolomeo ha le mani poggiate sul tavolo e si tende con il corpo verso Cristo: dà l'impressione non voler credere alle terribili parole che ha sentito e chiede come una conferma. Giacomo Minore poggia una mano sul braccio di Andrea, e con l'altra tocca la spalla di Pietro, nel gruppo successivo. Andrea sta fermo al suo posto e solleva in alto le mani con i palmi rivolti all'esterno, come per allontanare da sé i sospetti.  
Nel secondo gruppo troviamo Pietro, Giuda e Giovanni. Giovanni, uomo di carattere tranquillo, ascolta in silenzio le parole che Pietro sussurra nel suo orecchio; Pietro ha in mano un coltello e reagisce con rabbia alle parole di Cristo. Giuda è isolato, con il gomito destro poggiato sul tavolo.